МЦ Радост

Оплождане на яйцеклетки

При класическо ин витро (IVF) всяка яйцеклетка се поставя заедно със сперматозоидите в специална хранителна среда и оплождането се извършва в лабораторни условия на принципа на естествена селекция.

При извършване на ICSI се инжектират само зрелите яйцеклетки със селектирани от ембриолога сперматозоиди, които са с нормална подвижност и морфология.

В дена след събирането и оплождането на яйцеклетките (Ден 1) ембриологът преценява дали оплождането е успешно.

Някои яйцеклетки е възможно да не са се оплодили. Това е пряко свързано с тяхното качество, други яйцеклетки може да са абнормално оплодени. Те не подлежат на трансфер. Нормално оплодените яйцеклетки (зиготи) се съхраняват в специална хранителна среда. Всеки ден ембриологът проследява развитието им, като записва всичко в ембриологичен протокол. На втория/третия ден след оплождането ембриологът извършва оценка на развитието на ембрионите. В случаите, когато повечето ембриони се развиват адекватно, се налага изчакване, за да могат да се селектират възможно най-качествените ембриони, достигнали до стадий бластоцист.

Развитие на ембрионите

За нас, ембриолозите, понякога е трудно да обясним на пациентите как се развиват техните ембриони, без да споменем някой по-неразбираем за тях термин, касаещ етапа на рзвитие на ембрионите за съответния ден, като „делящ се”, „отговарящ на деня си ембрион”, „компактизирал ембрион”, „експандирал” и „неекспандирал” бластоцист и т.н. Затова, за да улесним Вас - пациентите, ще обясним ден по ден какво се случва с ембрионите и как те би трябвало да се развиват и да изглеждат.

Първият стадий на развитие на ембриона е оплодената яйцеклетка или стадий зигота. Яйцеклетките обикновено показват признаци на оплождане 16-18 часа след инжектирането чрез ICSI. Това, което трябва да се види при оценяване на ембриона на този етап, са две добре диференцирани временни структури, наречени пронуклеуси (PN), централно разположени в яйцеклетката.

Какво е най-важното за стадий 2PN? Този етап е кратък, продължава само няколко часа и се наблюдава на 16-18-ия час след инжектирането. Ако наблюдаваме различен брой PN от два (един, три, четири и т.н.) – това показва атипично оплождане, тоест броят на пронуклеусите не е нормален, което е непоправимо, и резултатът в крайна сметка е ембрион, който, дори да показва някакво развитие по-нататък, не може да бъде трансфериран в матката на жената. Зиготите с абнормален брой PN могат да се делят и да продължават да се развиват, но не биха могли да доведат до нормална бременност. Затова ние, ембриолозите идентифицираме тези абнормно оплодени яйцеклетки и да ги отделяме от останалите нормално оплодени ембриони.

В МЦРМ „Нова Радост“ използваме система за оценяване на зиготите или Z-оценка въз основа на пронуклеусите.

Стадий на делене. Когато оплодената яйцеклетка се раздели за пръв път и формира две клетки, то тогава тя навлиза в този етап (стадий) на делене. Терминът „делящ” означава, че клетката се е разделила от една клетка на две. Клетките на 2-клетъчния ембрион продължават да се делят, превръщайки се в 4-клетъчен ембрион. Когато всяка клетка от 4-клетъчния ембрион се раздели още веднъж, тогава се формира един 8-клетъчен ембрион.

*ЗАБЕЛЕЖКА: Относно „дните” на култивиране на ембрионите: нулев ден е денят на фоликулната пункция, в който се инжектират яйцеклетките. Признаците на оплождане се наблюдават на Ден 1-ви. Разделянето до 2-клетъчен стадий нормално се очаква на Ден 2-ри от култивирането, докато разделянето на ембриона на 8 клетки се очаква на Ден 3-ти.

Какво е най-важното за стадия на делене? Ембриолозите дълго оглеждаме характеристиките на ембриона на този етап, за да може да преценим кои ембриони отпадат от селекцията за евентуалния ембриотрансфер. Радостни сме, когато видим характеристики като: еднакви по размер клетки и малка или липсваща фрагментация в структурата на ембрионите.

Има лека вариабилност в броя на клетките на ембрионите, които наблюдаваме на Ден 3-ти от развитието им. Най-добри прогнози имат тези ембриони, които са достигнали 7-8 клетки в структурното си развитие. Ако ембрионът е все още на две клетки на Ден 3-ти, това не е добър знак и е индикатор, че ембрионът е спрял да се развива. Нормалните ембриони имат строг ред за прогресия, който започва в момента на оплождането. Ако моментът на оплождане е закъснял (например, ако е използвано „спасително” ICSI (rescue ICSI), стартовото време на програмата за прогрес на ембриона е закъсняло и ембрионът може да достигне 8 клетъчен стадий на ден 4-ти, не на ден 3-ти. Прогресията трябва да върви по очаквания начин. Ембрионите обикновено не се забързват, за да наваксат.

Стадий морула. Стадий морула се характеризира с трансформация от слабо обединени клетки до здраво свързани клетки, които вече изглеждат като тъкан. Процесът, при който клетките се променят, се нарича компактизация. Компактизиралата морула е група от клетки. Този етап обикновено се наблюдава на ден 4-ти от развитието (култивирането). Името морула идва от черница (латинското име на която е Morus), защото морулата изглежда точно като този плод.

Какво е най-важното за този стадий? Понякога ембрионите остават на стадий клетки и никога не компактизират. Това е лош знак и означава, че ембрионът вече не е жизнен. Клетки или големи фрагменти, които остават извън компактизиралата морула, не са живи.

Стадий бластоцист. Достигането до стадий на развитие бластоцист се смята за много добър знак за бъдеща имплантация и настъпване на бременност. В типичния ин витро цикъл някои ембриони спират да се развиват на определен етап. Необичайно е 100 % от оплодените яйцеклетки на пациентите да достигнат този стадий, но не е невъзможно. На стадий бластоцист ембрионите достигат от 50 до 150 клетки и започват да се разпъват до границата на зона пелуцида. Това разпъване не се дължи на клетъчното делене, а на активното изпомпване на течност от ембрионалните клетки във вътрешното пространство на бластоциста, формиращо по този начин кухина (бластоцьол). Изпълването на това пространство с течност разширява (от англ. Expand) бластоциста и затова този ембрион се нарича експандирал бластоцист. Преди формирането на това течнопространство бластоцистът се нарича неекспандирал (ранен). Разширяването на бластоциста помага на зоната да изтънее и евентуално подпомага разтварянето на зона пелуцида. По този начин бластоцистът може да излезе от нея - това е т. нар. хетчване (от англ. hatching – излюпване).

В хубаво експандиралия бластоцист ние, ембриолозите, можем да видим вътреклетъчната маса (ICM – inner cell mass) във вътрешността на ембриона. Вътреклетъчната маса съдържа клетки, които формират истинските клетки на плода. Другите клетки, които заобикалят и предпазват вътреклетъчната маса и очертават вътрешната страна на зона пелуцида, са трофектодермалните клетки (TE – Trophectoderm). Клетките на трофектодермата формират феталната част на плацентата.

Какво е най-важното за стадий бластоцист? Ембрионът трябва да има вътреклетъчна маса. Липсата на такава означава, че жизненият цикъл за този ембрион приключва. Такива бластоцисти не се трансферират. Друг „лош” знак за бластоциста е, когато изглежда, че има малко на брой клетки, което означава, че трансформационната програма е започнала преди клетъчното делене да свърши, оставяйки ембриона с неадекватна основа от клетки за по-нататъшното развитие. Стадий балстоцист обикновено настъпва на ден 5-ти от култивирането (след оплождането) и ние бихме могли да видим хетчване на този или следващия ден (Ден 6-ти).Има и една друга особеност на бластоцистите и това е тяхната способност да експандират и да се свиват. Експандиралите бластоцисти могат да „колабират” и да изглеждат неекспандирали. С времето, бластоцистите отново се изпълват с течност и отново експандират. „Компактният” бластоцист вероятно е преходно състояние, при което напълно разтворилия се бластоцист „спада”. Докато бластоцистът е способенда експандира, това временно „спадане” не е проблем. Фактически, преди витрификация (замразяване), много ембриолози колабират бластоцистите, за да оптимизират витрификационния процес. След замразяване и размразяване, знак за възстновяване е реекспандирането на бластоциста, което показва, че ембрионът е жив.

Каква е връзката между целия този прогрес в развитието на ембриона и възможността за постигане на успешна бременност?

Определянето на това кои ембриони биха се имплантирали и биха довели до успешна бременност е „Светият граал” в ембриологията. Оценяването въз основа на външния вид на оплодената яйцеклетка, на развиващия се (делящия се) ембрион или достигането до стадий бластоцист – всички тези факти се използват от нас, ембриолозите, да определим кои ембриони имат потенциал да доведат до бременност и кои – не. Прогресията в развитието на ембрионите е добър функционален тест за жизнеността им. Селекцията на ембриони, култивирани до Ден 5-ти, е добър метод за идентифициране на качествените от тях, при условие, че съответната пациентката има по-голям брой нормално развиващи се ембриони от възможните за трансфериране на по-ранен ден от развитието им. В крайна сметка, дори използвайки всички тези ембрионални характеристики, за които се предполага, че биха довели до настъпване на имплантация и последваща бременност, все още, за съжаление, не съществува единен метод, който с точност да определя кой ембрион ще има потенциал да доведе до успешна бременност.

Ембриотрансфер

Ембриотрансфер се осъществява в специално оборудвано помещение. Анестезия не е необходима, освен в случаите, когато, по преценка на лекуващия гинеколог, не е препоръчана такава при съмнения от негова страна, че процедурата би причинила на пациентката болка и дискомфорт. Непосредствено преди предстоящ и по време на ембриотрансфер е забранена употребата на парфюми, лакове и пяна за коса, защото те са токсични за ембрионите. В деня на ембриотрансфера ембриологът и гинекологът обсъждат съвместно статуса на развитите ембриони: техния брой, качество, брой на клетките/стадий, до които е достигнало развитието на всеки един от тях. На базата на тази дискусия, възрастта на жената и законовите разпоредби, екипът взема решение кои от ембрионите да бъдат трансферирани. По време на ембриотрансфера акушер-гинекологът извършва преценка на позицията на матката и измерва дължината на маточната шийка. Лекарят връща ембрионите в маточната кухина на жената с помощта на специален катетър за ембриотрансфер. След това ембриологът преглежда катетъра за случайно останали ембриони при запушване на катетъра със слуз и/или кръв. Ако няма останали в катетъра ембриони, ембриотрансферът се приема за успешно осъществен. След приключване на процедурата жената остава за наблюдение в продължение на няколко часа, след което се изписва. Препоръчително е пациентката да избягва интензивни дейности, фитнес упражнения, полов живот до момента на установяване на бременност. Препоръчително е да се извърши кръвен тест за бременност 14 дни след ембриотрансфера. Уринен тест не се препоръчва при жени, подложени на ин витро процедура поради специфичната терапия и възможните фалшиво-положителни резултати. Ако кръвният тест е положителен, пациентката продължава с изписаната от лекуващия акушер-гинеколог терапия. След около две седмици тя посещава клиниката отново за ултразвуково изследване и за евентуално установяване на клинична бременност.

Митът: Ембриотрансфер на Ден 5-ти (трансфер на стадий бластоцист) е по-добре от Ембриотрансфер на Ден 2-ри или 3-ти (трансфер на стадий на делене).

Фактите: Трансферът на бластоцисти навлезе в ембриологичната практика преди десетилетие. Невероятно е да видиш как ембриони се развиват до стадий бластоцист при ин витро условия, а и е успокоително да знаеш, че средите за култивиране и условията в ин витро лабораториите са се подобрили толкова много, че рутинно могат да се отглеждат ембриони до Ден 5-ти.

Въпросът е това наистина ли е полезно за пациента?

Много ин витро клиники твърдят, че процента на бременностите се е покачва при трансфериране на бластоцисти в сравнение с трансфер на ембриони на стадий на делене (клетки).

Въпросът е какво се случва по време на развитието на ембрионите?

Човешкият ембрион започва своето развитие от стадий зигота. Зиготата е началната клетка, която се образува от сливането на сперматозоида и яйцеклетката. Зиготата съдържа генетичен материал от двамата родители. 30 часа след оплождането тя се разделя на две клетки – бластомери, и вече се нарича ембрион. На Ден 3-ти от оплождането ембрионите обикновено вече са достигнали 8 бластомера. Ембриотрансфер на ембрион на стадий делене (клетки) обикновено се извършва на този ден. Ембрионът продължава да се дели и на Ден 5-ти вече съдържа между 70 и 100 клетки. На този етап ембрионът вече се нарича бластоцист. Бластоцистът съдържа т.нар. вътреклетъчна маса, от която се формира фетусът, както и външен слой от клетки, които се наричат трофектодерма (трофобласт). От трофектодермата се формира плацентата.

Срещата на сперматозоида с яйцеклетката при нормални условия се осъществява във фалопиевите тръби, където ембрионът остава за около 4 дни. Нежните контракции на фалопиевите тръби избутват ембриона до матката, като това реално се случва на 4/5-ти ден от оплождането, т.е на стадий бластоцист.

Ако при нормално забременяване ембрионът достига матката, когато е бластоцист, то не е ли логично трансферът на ембриони, получени ин витро да се извършва в същия този период и така да се осъществи синхрон между ембриона и ендометриума (лигавицата на матката)?

Когато ембрионите се развиват в лабораторни условия в инкубатори, не всички от тях достигат до стадий бластоцист. Много от тях спират да се делят още в началните етапи на развитието. В определени случаи трансфер на стадий бластоцист отстъпва място на трансфер на ембриони на стадий делене. Те са достатъчно жизнени и могат да доведат до успешна бременност и раждане при попадане в майчиния организъм.

Възможно ли е по-добрата селекция на ембриони да повиши процента клинични бременности?
Логично е трансферът на бластоцисти да доведе до подобряване на процента постигнати клинични бременности след процедура по асистирана репродукция, но логичният отговор не винаги е достатъчен, за да се разгадаят всички биологични тайни на възникването на живот. В клиничната практика се доказа, че трансферът на стадий бластоцист не винаги е по-добър от трансфер на стадий на делене на ембрионите.

1. Трансфер на стадий бластоцист е възможно да доведе до по-висок процент на канселирани ембриотрансфери (тоест не се извършва ембриотрансфер поради липса на жизнени ембриони). Не всички ембриони се развиват до стадий бластоцист, особено когато жените са в напреднала възраст; същото важи и за жените с лош яйчников отговор (изчерпан яйчников резерв), както и за жените с лошо качество на ембрионите. Такива жени са с висок риск за канселиране на цикъла, ако нито един от техните ембриони не е достигнал до стадий бластоцист.

2. При пациенти с малко на брой ембриони или в напреднала възраст шансовете за забременяване са по-високи, ако бъде извършен трансфер на стадий на делене. Най-важната цел на всеки един ин витро цикъл е да доведе до раждане на живо и здраво дете.
Някои автори твърдят, че процентът на живите раждания се покачва леко с трансфера на бластоцисти, поради което логично е да се реши, че трансфер на Ден 5-ти е много по-добре от трансфер на Ден 2-ри/3-ти. Други автори пък твърдят, че няма разлика в процента на клиничните бременности или процента на аборти между трансфер на стадий на делене и трансфер на бластоцисти. Въпросът „Да правим ли трансфер само на стадий бластоцист или не?” не се поставя при случаи на млади жени с много яйцеклетки и ембриони – нормално е при такива случаи да се изчака до Ден 5-ти от развитието на ембрионите. Спорът е в случаите, когато се касае за възрастни жени и жени с намален яйчников резерв, където прогнозите са доста по-лоши. Трансферът на стадий бластоцист не е от полза при по-възрастните жени и тези с малко на брой ембриони. Присъствието на висок процент анеуплоидни ембриони при по-възрастните жени намалява техните шансове за успех, затова, когато има малък брой ембриони, по-разумно е да трансферираме тези ембриони възможно най-рано в матката, защото най-важното правило в медицината е „не вреди”! Трябва да се знае, че дори при млади жени с много на брой ембриони с добро качество едва максимум 35-40 % достигат до стадий бластоцист.

Въпросът всъщност е дали ембриони, които не се превръщат в бластоцисти, могат да постигнат бременност, ако се трансферират на по-ранен ден от развитието им?
В настоящия момент не съществуват солидни доказателства за категоричен отговор на този въпрос. В случая по-разумно решение е да направим ранен трансфер на Ден 2-ри/3-ти при жени, които са с лоша прогноза. Наистина, съществува висок риск техните ембриони да спрат да се развиват в изкуствените условия на икубаторите, ако се опитаме да ги отглеждаме до Ден 5-ти; като резултат е възможно изобщо да не останат ембриони за трансфер. Друг, не по-малко важен аспект, е емоционалното влияние върху пациентите, когато те останат без ембриони за трансфер. 40 и повече процента от ембрионите на пациентите с лоша прогноза няма да достигнат стадий бластоцист в лабораторни условия.

Ние считаме, че плюсовете на трансфер на Ден 5-ти при по-възрастните жени са по-малко в сравнение с трансфер на Ден 2-ри/3-ти. Ние вярваме, че трансферът на по-ранен ден (2-ри, 3-ти ден) е много по-добър вариант за някои специфични групи пациентки (с лош яйчников отговор и/или в напреднала възраст), докато при тези с добра прогноза е редно да се изчака до Ден 5-ти.